硫氧还蛋白还原酶1 (thioredoxin reductase 1, TrxR1) 是TrxR1基因编码的产物，是生物细胞内维持氧化还原稳态的关键酶之一[1]。TrxR1利用其蛋白结构C-端中的氧化还原活性中心，将还原型辅酶Ⅱ (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH) 的电子转移给其底物蛋白硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)，将氧化型Trx蛋白活性中心中半胱氨酸残基上的二硫键还原成巯基，并通过Trx的自身氧化还原促进体内多种重要蛋白的还原，进而参与多种疾病的发生发展，如神经退行性疾病、心血管疾病以及肿瘤等[2-4]。近年来，通过高通量筛选等手段已经发现多种TrxR1调控剂，如auranofin等含金属类化合物和荜茇酰胺等天然产物[5-6]。但这些化合物的发现通常基于TrxR1酶活力检测，缺乏对于细胞内乃至体内TrxR1靶点选择性的研究，因而会出现化合物脱靶现象。而TrxR1基因编辑细胞的构建，有望在化合物研究早期明确细胞内作用靶点，节省研发成本。
CRISPR/Cas (clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated) 系统起源于细菌与古细菌在漫长的演变过程中形成的一种保护自身不被外界侵害的免疫防御系统[7]。CRISPR/Cas系统根据所使用的Cas蛋白可分为3类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型系统——CRISPR/Cas9系统能够诱导靶基因DNA双链的断裂，编辑效率较高，因而使用最为广泛[8]。CRISPR/Cas9系统是由2个部分组成：小向导RNA (small guide RNA, sgRNA) 和CRISPR相关蛋白9 (CRISPR associated protein 9, Cas9)。sgRNA与Cas9结合，诱导构象变化，激活蛋白。一旦Cas9被激活，它就会通过与其前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM) 匹配的序列结合来搜索靶基因DNA, 如果互补区和靶区配对正确，则RuvC和HNH核酸酶结构域将切割靶DNA的两条链，使DNA的双链断裂，而后细胞通过非同源末端连接(non homologous end joining, NHEJ) 或同源定向修复(homology directed repair, HDR) 等机制对断裂的DNA双链进行修复，从而导致在断裂处正常碱基消失或插入异常的碱基，造成移码突变，最终达到目的基因敲除的目的[8-9]。
本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了一株TrxR1基因稳定敲除的HCT-116细胞系HCT116-TrxR1-KO，并通过DNA测序、免疫蛋白印迹、TRFS-green荧光探针、细胞内TrxR1酶活力检测和CCK-8实验等方法鉴定和验证该细胞的TrxR1基因敲除效果以及初步研究靶向TrxR1小分子化合物对细胞内TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制的相关性。最终证明，HCT116- TrxR1-KO细胞内无TrxR1蛋白表达，而TrxR1靶向抑制剂auranofin对该细胞的细胞内TrxR1酶活力和细胞增殖力无抑制效果。联合正常或对照HCT-116细胞的实验结果，可以在细胞水平快速筛选出脱靶化合物，有利于快速推进TrxR1靶向化合物的研究，为相关疾病的发生机制研究和治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 全波长酶标仪和二氧化碳培养箱购于Thermo Fisher Scientific公司，流式细胞仪购于Agilent公司，倒置荧光显微镜购于奥林巴斯公司，小型垂直电泳仪和多功能凝胶成像系统购于Bio-Rad公司。
1.1.2 试剂 HCT-116 (人结直肠癌细胞) 由本实验室保存，质粒提取试剂盒购于天根生物科技有限公司，CCK-8 (cell counting kit-8) 细胞增殖试剂盒购于Dojindo公司，Page凝胶快速制备试剂盒购于雅酶生物科技有限公司，胎牛血清、RPMI-1640 (roswell park memorial institute-1640) 培养基、DMEM (dulbecco’s modified eagle’s medium) 培养基、PBS (phosphate buffered saline)、青霉素-链霉素双抗、嘌呤霉素、胰酶消化液(含0.25% EDTA)、蛋白marker、BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、GAPDH购于Thermo Fisher Scientific公司，NADPH、胰岛素、EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid)、大鼠肝脏硫氧还蛋白还原酶和人重组硫氧还蛋白购于Sigma-Aldrich公司，兔源单克隆抗人TrxR1抗体购于Abcam公司，5×蛋白上样缓冲液和RIPA裂解缓冲液购于碧云天生物技术研究所，PVDF膜购于Millipore公司，细胞培养皿及细胞培养板购于Corning公司。pCasCMV-Puro-U6质粒购自通用生物系统(安徽) 有限公司。
1.2 重组质粒的构建 敲除载体pCasCMV-Puro-U6质粒基于pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459) 载体构建，将pCasCMV-Puro-U6空质粒载体用限制性内切酶BbsⅠ酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳回收大片段pCasCMV-Puro-U6-Linear，用T4 DNA连接酶将退火磷酸化后的sgRNA产物与酶切回收产物连接得到连接产物，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，均匀涂在氨苄青霉素抗性平板上，培养挑取单克隆菌落，摇菌扩增，将菌液送去测序，经测序验证，敲除载体构建正确，获得纯化的重组表达载体为pCasCMV-TrxR1-KO1、pCasCMV-TrxR1-KO2、pCasCMV-TrxR1-KO3。
1.3 质粒提取与转染 取HCT-116细胞按5.0×105个/孔的密度接种于24孔板内，加入500 μL不含抗生素的DMEM完全培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。当细胞汇合度为80%–90%时，分别将0.5 μg的重组表达载体pCasCMV-TrxR1-KO1和pCasCMV- TrxR1-KO3、pCasCMV-TrxR1-KO2和pCasCMV- TrxR1-KO3稀释于25 μL无血清DMEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育5 min。分别取0.8 μL转染试剂于25 μL无血清DMEM培养基中，室温孵育5 min。而后将稀释的DNA和稀释的转染试剂混合，孵育15 min。将转染复合物加入24孔板中混匀，放入细胞培养箱中培养。培养4 h后弃去含有转染复合物的培养基，更换为DMEM完全培养基，培养48 h后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。同时，按照相同方法转染空质粒载体，作为对照细胞，命名为HCT116-NC。
1.4 TrxR1敲除稳定细胞株的筛选 在24孔板内按3×104个/孔的密度接种转染后的HCT-116细胞，每孔加入500 μL完全培养基，培养过夜。而后将完全培养基更换为含嘌呤霉素浓度为0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的培养基。培养24 h后再次更换含对应浓度嘌呤霉素的培养基，继续观察24 h，然后将含嘌呤霉素的培养基更换为500 μL无嘌呤霉素培养基；72 h后无细胞存活的实验组的嘌呤霉素浓度即为筛选浓度，为3 μg/mL。使用含有3 μg/mL嘌呤霉素的培养基培养转染后的细胞2 d，而后提取细胞基因组，PCR扩增后测序。将测序正确的细胞计数、稀释，以1–1.5个细胞密度接种到96孔板中，培养1周后挑取单克隆，对单克隆细胞进行筛选。最终筛选得到的细胞即为TrxR1稳定敲除细胞，命名为HCT116-TrxR1-KO。
1.5 Western blotting印迹鉴定稳定转染细胞系中TrxR1的表达 分别将HCT-116、HCT116-NC与HCT116- TrxR1-KO细胞消化计数，铺于细胞培养皿中，待细胞长满后，消化离心收集细胞，加入适量裂解液裂解细胞，冰上裂解30 min，离心10 min，取上清蛋白液。用BCA法对所提取的细胞蛋白进行定量，取30 μg总蛋白，使用4%–20%的梯度SDS-PAGE电泳分离，以300 mA恒流将蛋白转移至PVDF膜上，5% (W/V) BSA (溶解于含有0.1% Tween-20的TBS溶液中，TBST) 室温封闭2 h，去离子水清洗膜后加入抗人TrxR1抗体后4 ℃孵育过夜。次日，将膜清洗3遍，每次5 min，然后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG于37 ℃孵育1 h，孵育完毕后，将膜再次清洗3遍，每次5 min，最后使用显影液孵育，在ChemiDoc Touch凝胶成像系统中成像拍照。使用Image J软件对照片灰度值进行定量。
1.6 TrxR1基因敲除细胞株中TrxR1酶活力测定 细胞中酶表达量的减少通常伴随着细胞中酶活力的下降，为了研究我们构建的HCT116- TrxR1-KO细胞株中与正常HCT-116细胞株中TrxR1酶活力相比的变化情况，分别将HCT-116、HCT116-NC与HCT116-TrxR1-KO细胞接种于细胞培养皿中，待细胞融合度达90%以上时，消化离心收集细胞，提取蛋白，并用BCA法进行定量，利用胰岛素终点酶活法测定上述各细胞中TrxR1活力[10]。将20 μg细胞总蛋白与50 μL含100 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)、0.3 mmol/L胰岛素、660 μmol/L NADPH、3 mmol/L EDTA和1.3 μmol/L Trx蛋白的100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6) 在37 ℃下孵育1 h，加入200 μL含1 mmol/L DTNB的6 mol/L盐酸胍(pH 8.0)终止反应，使用BioTek Cytation 5酶标仪检测设置为化学显色模式，在412 nm波长下进行检测。用相同方法，使用梯度稀释的大鼠肝脏TrxR1蛋白(218.53 U/mg，Sigma公司) 绘制标准曲线，利用标准曲线计算出各样品中TrxR1酶活力。
1.7 TrxR1基因敲除细胞株中TrxR1酶活力成像分析 利用特异性TrxR1酶活力荧光探针TRFS-green分别检测HCT-116、HCT116-NC和HCT116-TrxR1-KO活细胞中的TrxR1酶活力，分别将HCT-116、HCT116-NC与HCT116-TrxR1- KO细胞以3.0×105个/孔的密度铺于6孔板中，待6孔板中细胞融合度达70%−80%时，使用TRFS-Green (10 μmol/L) 孵育4 h，将处理后的细胞用EVOS FL荧光显微镜进行观察，通过平行实验使用流式细胞仪定量荧光强度[11-13]。
1.8 TrxR1敲除细胞株的功能检测 为了研究TrxR1稳定敲除细胞株的功能，验证其是否适用于靶向TrxR1小分子化合物的初步筛选。利用上述TrxR1酶活力测定方法，检测TrxR1特异性抑制剂auranofin对细胞株内TrxR1酶活力的抑制活性。将细胞以3.0×105个/孔的密度铺于6孔板中，过夜培养，观察待细胞融合度达70%−80%时，按梯度给药auranofin培养24 h，对照孔加入相同体积的二甲亚砜。数据按照对照孔数值归一化处理。
进一步利用CCK-8试剂盒分别研究auranofin对HCT-116、HCT116-NC与HCT116- TrxR1-KO细胞的增殖抑制作用。将细胞以2 000个/孔的密度接种于96孔板中，培养12 h后。实验组给药auranofin，对照组加入与auranofin相同体积的二甲亚砜，继续培养24 h后，加入10 μL/孔CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，使用酶标仪在450 nm处测量吸光值用以计算细胞增殖力。细胞增殖抑制率=(OD对照–OD实验)/(OD对照– OD空白)×100%。
2 结果与分析
2.1 重组表达载体pCasCMV-TrxR1的构建与鉴定 根据Cas9靶点设计原则设计出3个敲除位点(表 1)，再根据敲除点位置设计得到sgRNA寡核苷酸双链序列(表 2)，将退火后的sgRNA产物与空质粒载体pCasCMV-Puro-U6 (图 1A)进行连接得到连接产物，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，平板培养转化后的感受态细胞，挑取单克隆进行测序，测序结果显示在酶切位点之间插入的片段位置、方向及序列与预期一致(图 1B)，证明靶向TrxR1基因的3个sgRNA序列均可插入pCasCMV-Puro-U6载体。
2.2 TrxR1基因敲除分析 将经过嘌呤霉素筛选后的细胞进行测序，发现在该群细胞中存在一定基因组被编辑的细胞。进一步进行单克隆筛选后，对单克隆细胞测序发现纯合阳性克隆单克隆细胞，该细胞中TrxR1基因共缺失了104个碱基(图 2)。
一般来说，移码突变会导致蛋白翻译的提前终止，而如果突变的区域在外显子的中部，可能不会影响转录后的内含子和外显子的剪切。为了提前规避这种可能性，对TrxR1基因的7个转录本按照原蛋白质编码区(coding sequence, CDS) 的翻译区域进行翻译预测，获得如下N端部分氨基酸序列(图 3A)。对于NM_001093771.3转录本缺失104 bp的等位基因，可导致产生长度为209个氨基酸的突变蛋白；对于NM_001261445.2转录本缺失104 bp的等位基因，可导致产生长度为109个氨基酸的突变蛋白；对于NM_001261446.2转录本缺失104 bp的等位基因，可导致产生长度为21个氨基酸的突变蛋白；对于NM_003330.4转录本缺失104 bp的等位基因，可导致产生长度为111个氨基酸的突变蛋白；对于NM_182729.3、NM_182742.3、NM_182743.3转录本缺失104 bp的等位基因，可导致产生长度为59个氨基酸的突变蛋白，而这种突变将导致TrxR1基因所有7个转录本的蛋白结构域丢失(图 3B)，综上可以推断突变后的TrxR1蛋白基本失去活性，证明TrxR1敲除细胞系构建成功。
2.3 Western blotting检测HCT116-TrxR1- KO细胞中TrxR1蛋白的表达 通过Western blotting，我们进一步发现HCT-116和HCT116-NC细胞中的TrxR1的表达量近乎一致，而HCT116-TrxR1-KO细胞中没有TrxR1的表达，证明我们成功构建了TrxR1基因稳定敲除细胞(图 4)。
2.4 HCT116-TrxR1-KO细胞内TrxR1酶活力测定 细胞中酶表达量的减少通常伴随着细胞中酶活力的下降，为了研究HCT116-TrxR1-KO细胞株与正常HCT-116细胞株中TrxR1酶活力相比的变化情况，我们通过胰岛素终点法，对HCT-116、HCT116-NC和HCT116-TrxR1-KO细胞中的TrxR1酶活力进行测定(表 3)。利用标准TrxR1蛋白绘制标准曲线(图 5)，基于标准曲线计算出HCT-116和HCT116-NC细胞中TrxR1的酶活分别为0.67 U/mg和0.70 U/mg，而HCT116-TrxR1-KO细胞因没有TrxR1表达无法计算出酶活(表 3)。
我们进一步通过TrxR1的特异性探针TRFS-green的活细胞成像来验证上述酶活力测定结果。TRFS-green探针需要TrxR1将其二硫键还原成巯基才可以发出绿色荧光，因此，装载过探针的细胞的绿色荧光强弱和细胞内TrxR1酶活成正比。结果显示，在使用相同浓度探针作用相同时间后，HCT116-TrxR1-KO细胞的绿色荧光强度显著弱于HCT-116和HCT116-NC细胞，联合细胞内TrxR1酶活检测结果，说明HCT116-TrxR1-KO细胞中确实不具有TrxR1酶活力，而该细胞中产生的微弱绿色荧光可能是由于TRFS-green探针与谷胱甘肽还原酶和脂酰胺脱氢酶等蛋白的反应而来[12] (图 6)。
2.5 HCT116-TrxR1-KO细胞中TrxR1酶活测定和细胞增殖毒性检测 为了初步研究HCT116-TrxR1-KO细胞是否适用于靶向TrxR1药物的筛选，我们首先利用TrxR1特异性抑制剂auranofin对HCT-116、HCT116-NC和HCT116-TrxR1-KO细胞中TrxR1酶活力的抑制效率进行了分析，结果显示，auranofin对HCT-116和HCT116-NC细胞中TrxR1酶活力抑制效率相当(IC50分别为(1.19±0.05) μmol/L、(1.05±0.11) μmol/L) (图 7A)，而对HCT116-TrxR1-KO细胞则无法检测到抑制效果。上述结果证明，auranofin因为HCT116-TrxR1-KO细胞中无TrxR1表达而无法在该细胞中发挥药效。而进一步通过CCK-8试验分别检测auranofin对上述3株细胞的增殖抑制作用，结果显示，auranofin对HCT-116和HCT116-NC细胞的增殖抑制作用相当(IC50分别为(1.13±0.08) μmol/L、(1.03±0.09)
μmol/L)，而对HCT116-TrxR1-KO细胞同样没有增殖抑制作用(图 7B)。综上，证明HCT116-TrxR1-KO细胞有助于确定靶向TrxR1药物在细胞内是否作用于TrxR1而发挥药效，因而该细胞的建立将有助于推动靶向TrxR1药物的研究。
3 讨论 Trx系统是抵御氧化应激的关键抗氧化系统，由Trx蛋白、TrxR蛋白和NADPH组成[14-17]。Trx是一种广泛存在的氧化还原调节蛋白，大多数的Trx都存在1个保守的活性位点(-cys-gly-pro-cys-)，活性位点中的2个半胱氨酸残基上的巯基能够可逆地形成二硫键，使Trx蛋白具有氧化和还原2种状态，从而参与细胞内多种蛋白质的还原[18-19]。TrxR1是目前为止已知的唯一能催化NADPH还原Trx的酶，在生理条件下，TrxR1可以将电子从NADPH经黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD) 传送给自身的二硫键活性位点，然后传送给氧化态的Trx，将Trx的二硫键(氧化型Trx) 还原成二硫醇(还原型Trx)，还原型Trx与不同的下游蛋白相互作用，调节各种生命过程，如维持细胞内氧化还原稳态、细胞生长和死亡以及基因转录[20-22]。并且TrxR1作为人体内主要的抗氧化酶，与多种疾病的发生发展密切相关。比如，当TrxR1活性受到抑制时，会发生氧化应激导致神经元细胞受到损伤，引起神经退行性疾病的发生[23-24]。而TrxR1功能过度活化时，常会引起肿瘤发生，因为与神经元细胞不同，肿瘤细胞通常含有较多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，因而往往处于较高的氧化还原状态。为了维持氧化还原平衡，肿瘤细胞会增强抗氧化系统功能，以避免氧化损伤，其中就包括了TrxR1表达水平的升高[25-26]。因此，目前针对TrxR1靶向化合物的开发，可以分为2个方面，一方面是诱导TrxR1，增强TrxR1活性，加强抗氧化功能，用于治疗神经退行性疾病，例如化合物1-脱氢-6-姜酮[27]、木香烃内酯[28]、绿原酸[29]和硫辛酰胺[30]，这些化合物可以导致核因子E2相关因子-2 (nuclear factor(eryt-hroid- derived2)-like 2 protein, Nrf2) 发生核易位，然后促进激活TrxR1等一系列Nrf2驱动的抗氧化分子，进而起到神经保护的作用；另一方面则是抑制TrxR1的活性，诱发氧化应激，促进肿瘤细胞死亡，比如本研究中使用的auranofin，就是目前被报道的特异性最高、抑制活性最强的含金属原子的TrxR1抑制剂，其通过迈克尔加成反应结合到TrxR1蛋白的497位半胱氨酸和498位硒代半胱氨酸残基上，阻止TrxR1蛋白和Trx蛋白的结合，诱导ROS产生，进而诱发肿瘤细胞死亡[31]。而天然产物姜黄素也属于多酚类TrxR1抑制剂，它同样会通过迈克尔加成反应结合到TrxR1蛋白的497位半胱氨酸和498位硒代半胱氨酸残基上，从而抑制TrxR1的活性[32]。
TrxR1作为在多种疾病中具有潜在治疗作用的药物靶点，其目前尚缺乏临床使用的有效药物。靶向TrxR1药物开发的一个突出问题就是缺乏可以有效快速评价药物特异性的细胞模型。基于前期研究成果，我们发现在瞬时转染TrxR1的沉默RNA (silencing RNA, siRNA) 后，细胞中降低的TrxR1表达量会诱导TrxR1抑制剂对TrxR1酶活力的抑制效率升高，同时也会诱导同浓度下TrxR1抑制剂对细胞增殖抑制率的升高。因而我们推测这种TrxR1细胞内表达量和TrxR1抑制剂活性的负相关性，可用于筛选TrxR1抑制剂及确定TrxR1抑制剂的特异性。而基因表达量的变化对细胞自身的影响会通过细胞传代而积累，可能会对我们的推测产生影响。因此，为了完善基于瞬时转染siRNA实验的推论，我们构建了稳定敲除TrxR1基因的HCT-116细胞株，并通过TrxR1特异性抑制剂auranofin验证了之前的推论。
近年来，研究者通过高通量筛选等手段已经发现多种TrxR1调控剂，这些化合物的发现通常基于TrxR1酶活力检测，缺乏对于TrxR1靶点选择性的研究，因而会出现化合物脱靶现象。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建的TrxR1基因敲除HCT-116细胞株，通过auranofin进行酶活力和细胞增殖抑制试验，证明该细胞适用于靶向TrxR1药物的快速细胞内靶点确证，可以很好地进行TrxR1靶点选择性的研究，因此该细胞的构建将为快速推进TrxR1靶向药物的开发提供良好的物质基础。